凝膠過濾的應(yīng)用
更新時間:2021-12-09 點擊次數(shù):2865
凝膠過濾是依據(jù)分子量的不同來進(jìn)行分離的,由于它的這一分離特性,以及它具有簡單、方便、不改變樣品生物學(xué)活性等優(yōu)點,使得凝膠過濾成為純化生物大分子的一種重要手段,尤其是對于一些大小不同,但理化性質(zhì)相似的分子,用其他方法較難分開,而凝膠過濾無疑是一種合適的方法,例如對于不同聚合程度的多聚體的分離等。
凝膠過濾測定分子量操作比較簡單,所需樣品量也較少,是一種初步測定蛋白分子量的有效方法。這種方法的缺點是測量結(jié)果的準(zhǔn)確性受很多因素影響。由于這種方法假定標(biāo)準(zhǔn)物和樣品與凝膠都沒有吸附作用,所以如果標(biāo)準(zhǔn)物或樣品與凝膠有一定的吸附作用,那么測量的誤差就會比較大。計算公式成立的條件是蛋白基本是球形的,對于一些纖維蛋白等細(xì)長形狀的蛋白不成立。另外由于糖的水合作用較強,所以用凝膠過濾測定糖蛋白時,測定的分子量偏大,而測定鐵蛋白時則發(fā)現(xiàn)測定值偏小。
利用凝膠過濾進(jìn)行脫鹽及去除小分子雜質(zhì)是一種簡便、有效、快速的方法,它比一般用透析的方法脫鹽要快得多,而且一般不會造成樣品較大的稀釋,生物分子不易變性。一般常用的是月旭科技Tandex G-25,并且目前已有多種脫鹽柱成品出售,使用方便,可多次使用。
熱源物質(zhì)是指微生物產(chǎn)生的某些多糖蛋白復(fù)合物使人體發(fā)熱的物質(zhì),它們是一類分子量很大的物質(zhì),所以可以利用凝膠過濾的排阻效應(yīng)將這些大分子熱源物質(zhì)與其他相對分子量較小的物質(zhì)分開。例如對于去除水、氨基酸、一些注射液中的熱源物質(zhì),凝膠過濾是一種簡單而有效的方法。
利用凝膠顆粒的吸水性可以對大分子樣品溶液進(jìn)行濃縮。例如將干燥的Tandex(粗顆粒)加入溶液中,Tandex可以吸收大量的水,溶液中的小分子物質(zhì)也會滲透進(jìn)入凝膠孔穴內(nèi)部,而大分子則被排阻在外。通過離心或過濾去除凝膠顆粒,即可得到濃縮的樣品溶液。這種濃縮方法基本不改變?nèi)芤旱碾x子強度和pH值。
為了減少高濃度下的聚集反應(yīng),凝膠過濾層析技術(shù)也可以用來進(jìn)行蛋白的體外復(fù)性。層析介質(zhì)的隔離作用,降低了蛋白之間相互作用產(chǎn)生的聚集,使復(fù)性濃度、復(fù)性率都得到很大的提高。同時,蛋白經(jīng)過凝膠過濾層析本身也可得到一定的純化。
兩個重要的因素影響凝膠過濾層析復(fù)性蛋白的收率:第一個是變性條件下蛋白質(zhì)的上樣,第二個是復(fù)性緩沖液中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化。另外,蛋白質(zhì)上樣量也會影響蛋白質(zhì)復(fù)性收率,因為在層析柱的頂端會因為上樣量的增加而發(fā)生結(jié)構(gòu)的聚集。
為了提高蛋白質(zhì)復(fù)性效率,發(fā)展了一種梯度凝膠過濾層析復(fù)性方法。在色譜柱中預(yù)先設(shè)置變性劑濃度的梯度,當(dāng)復(fù)性的蛋白質(zhì)進(jìn)入到柱子中后,由于蛋白質(zhì)的表觀分子量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于變性劑,從而蛋白質(zhì)經(jīng)過了一個變性劑濃度逐步降低的環(huán)境,蛋白質(zhì)逐步地折疊復(fù)性,從而有效地降低了聚集體的形成,并能把聚集體和折疊的蛋白質(zhì)進(jìn)行分離。
線性梯度在凝膠過濾層析中可能經(jīng)常會遇到,但是有時有些蛋白質(zhì)可能在某些變性劑濃度下不穩(wěn)定,在梯度過程中需要盡快跨越這些濃度過程;有時蛋白質(zhì)折疊的限速在某些變性劑濃度下,此時需要增加此段的時間,所以在凝膠過濾層析中可以設(shè)計不同類型的梯度形式,以滿足不同的蛋白質(zhì)的復(fù)性需要。